重组人胰岛素类似物的HPLC分析
目的:探讨HPLC分析在重组人胰岛素类似物鉴别和杂质检测中的适用性。方法:采用反相色谱柱(C18),以硫酸钠-磷酸缓冲液(0.2mol.L-1,pH2.3)和乙腈为流动相,流速0.8或1.0mL.min-1,柱温40℃,检测波长214nm;用分子筛柱(ZorbaxGF250)以磷酸铵缓冲液(0.1mol.L-1,pH7.5)和乙腈为流动相,流速0.5mL.min-1,检测波长214nm;检测重组人胰岛素类似物及其酶解片段。结果:获得胰岛素及其类似物的RP-HPLC图谱,肽图谱和体积排阻色谱(HPSEC)图。结论:本文方法能够有效地区别和检测胰岛素类似物及有关物质,为该类药物的质控提供了科学依据。
关键词:重组人胰岛素类似物肽图谱反相液相色谱体积排阻色谱
重组人胰岛素类似物(rhInsulinlispro)是重组人胰岛素分子B链上第28位的脯氨酸和第29位的赖氨酸位置互换产物。其降血糖作用更迅速。临床上作为快速降糖药物,其制剂的商品名为优泌乐(HumalogTM),该药已被FDA批准上市,并进口我国。在药品检验中,如何区分一级结构仅有微小差别的人胰岛素和人胰岛素类似物,本文试用RP-HPLC法和HPSEC法对其分子或酶解片段进行了分析。
1、仪器与材料
1.1仪器岛津LC-10AD泵、CTO-10A柱温箱、SPD-10A检测器、DGU-4A脱气机、C-R7Aeplus积分仪。
1.2材料重组人胰岛素类似物(rhInsulinlispro)对照品及其注射液(HumalogTM)、B30脱苏氨酸重组人胰岛素由美国Elilly公司提供;重组人胰岛素对照品、重组人胰岛素-A21脱氨人胰岛素对照品、猪胰岛素-A21脱氨猪胰岛素对照品、重组人胰岛素类似物单体-二聚体对照品(中国药品生物制品检定所);重组人胰岛素为国产原料;V8蛋白酶为Sigma产品;乙腈为色谱纯试剂,其它试剂均为国产分析纯。
2、方法与结果
2.1 肽图谱测定取重组人胰岛素类似物对照品、重组人胰岛素对照品和B30脱苏氨酸重组人胰岛素适量,用0.1%的CF3COOH溶液制成每1mL中含10mg的溶液;取20μL,加0.2mol.L-1Tris-盐酸缓冲液(pH7.3)20μL,0.1%V8蛋白酶溶液20μL,水140μL,混匀,置37℃水浴2h后,加85%的磷酸溶液3μL终止反应,作为酶解样品溶液;另取重组人胰岛素类似物对照品、重组人胰岛素对照品和B30脱苏氨酸重组人胰岛素适量,以水代替V8蛋白酶同法制备非酶解样品溶液。采用Vydac Protein and Peptide C18色谱柱(250mm×4.6mm);柱温40℃;流速1.0mL.min-1;检测波长214nm;以0.2mol.L-1硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(90∶10)为流动相A,乙腈-水(50∶50)为流动相B;进行梯度洗脱。初始状态为10%B,5min时流动相B增至20%,45min时流动相B增至60%,保持5min。取上述酶解样品溶液和非酶解样品溶液各20μL分别注入液相色谱仪,记录色谱图。
1. 重组人胰岛素类似物酶解样品
2. B30脱苏氨酸重组人胰岛素酶解样品
3. 重组人胰岛素酶解样品
4. 重组人胰岛素非酶解样品
5. 重组人胰岛素类似物非酶解样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ—人胰岛素酶解片段代号
2.2 RP-HPLC鉴别取重组人胰岛素-A21脱氨人胰岛素对照品、牛胰岛素、猪胰岛素-A21脱氨猪胰岛素对照品和重组人胰岛素类似物对照品适量,各用0.01mol.L-1盐酸溶液分别制成每1mL中含2.8mg的溶液,取上述4种溶液等体积混合,制得混合样品溶液;采用SpherisorbODSⅡ(100mm×4.6mm)色谱柱;流速0.8mL.min-1;柱温40℃;检测波长214nm;以0.2mol.L-1硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(75∶25)为流动相。分别取各种胰岛素溶液和混合样品溶液各20μL注入液相色谱仪,记录色谱图,确定不同保留时间对应的成分。
2.3 RP-HPLC分析重组人胰岛素类似物及有关物质取A21脱氨人胰岛素类似物对照品适量,用0.01mol.L-1盐酸溶液制成每1mL中含3.5mg的溶液作为系统适用性样品溶液;取重组人胰岛素类似物注射液,用0.01mol.L-1盐酸溶液调pH约为5.3时,其中重组人胰岛素类似物形成白色沉淀,4000g离心10min,取上清液作为空白注射液;采用Vydac Protein and Peptide C18色谱柱(250mm×4.6mm);柱温40℃;流速1.0mL.min-1;检测波长214nm;以0.2mol.L-1硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(82∶18)为流动相A;0.2mol.L-1硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(50∶50)为流动相B,洗脱梯度初始状态流动相B为19%,保持60min,在23min内流动相B增至49%,保持5min。取上述样品溶液和重组人胰岛素类似物制剂空白各20μL注入液相色谱仪。
2.4 HPSEC分析取重组人胰岛素类似物原料、重组人胰岛素类似物制剂、重组人胰岛素类似物单体-二聚体对照品用流动相制成浓度为每1mL约含0.7mg(20U)的溶液。采用ZorbaxGF250Special(25cm×9.4mm)分析色谱柱;以0.1mol.L-1磷酸铵缓冲液(pH7.5)-乙腈(65∶35)为流动相;流速0.5mL.min-1;检测波长214nm。取上述样品溶液20μL注入液相色谱仪,记录色谱图。
3、讨论
3.1 鉴别重组人胰岛素类似物的分子结构如图5所示。实验中使用的V8蛋白酶能专一裂解谷氨酸的羧基端肽键。在非还原条件下,用V8酶水解重组人胰岛素类似物分子,理论上可产生4个片段,即Ⅰ(A5-17与B1-13)、Ⅱ(A18-31与B14-21)、Ⅲ(B22-30)、Ⅳ(A1-4)。而在本实验条件下,则多了一个中间片段,即Ⅴ(A1-17与B1-13),这是片段Ⅰ和Ⅳ聚合的结果。人胰岛素和B30脱苏氨酸人胰岛素以及重组人胰岛素类似物的酶解片段Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ的保留时间是相同的,分别为1460、730、220和1600s,但片段Ⅲ的保留时间则有差别,分别为660和550以及630s。由此可见,通过肽图谱分析鉴别胰岛素类似物是非常有效的。由图2可见,本文的RP-HPLC方法能有效地区分人、猪、牛胰岛素和重组人胰岛素类似物。此法快速、不受其它成分干扰。
3.2 杂质分析重组人胰岛素类似物在高温高湿度条件下,易产生高分子量蛋白(HMWP),如在40℃,75%相对湿度下,HMWP的增加速率为每天0.16%;而在酸性条件下,易形成脱氨产物,如其酸性溶液在室温放置时,A21脱氨重组人胰岛素类似物的增加速率为每天0.6%。本文据此制备系统适用性样品,在RP-HPLC线性梯度洗脱分析中,重组人胰岛素类似物与其A21脱氨产物的分离度为2.6,按重组人胰岛素类似物峰计算,其理论塔板数为5350;而在HPSEC分析中,分离度以二聚体峰高与单体和二聚体间的峰谷高之比表示,其值应大于2.0,按重组人胰岛素类似物单体峰计算,其理论塔板数为6200。
综上所述,本文方法能有效地区分人、牛、猪胰岛素与人胰岛素类似物,能检测分离人胰岛素类似物及有关物质和高分子量蛋白。结果为该类药物的质控提供了科学依据。
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